Чтобы обеспечить равный доступ для всех пользователей, SEC оставляет за собой право ограничивать запросы, исходящие от необъявленных автоматизированных инструментов. Ваш запрос был идентифицирован как часть сети автоматизированных инструментов за пределами допустимой политики и будет обрабатываться до тех пор, пока не будут приняты меры по объявлению вашего трафика.

Пожалуйста, объявите свой трафик, обновив свой пользовательский агент, чтобы включить в него информацию о компании.

Для лучших практик по эффективной загрузке информации из SEC.gov, включая последние документы EDGAR, посетите sec.gov/developer. Вы также можете подписаться на рассылку обновлений по электронной почте о программе открытых данных SEC, включая передовые методы, которые делают загрузку данных более эффективной, и улучшения SEC.gov, которые могут повлиять на процессы загрузки по сценариям. Для получения дополнительной информации обращайтесь по адресу opendata@sec. gov.

Для получения дополнительной информации см. Политику конфиденциальности и безопасности веб-сайта SEC. Благодарим вас за интерес к Комиссии по ценным бумагам и биржам США.

Идентификатор ссылки: 0.7ecef50.1637223896.12df5ede

Дополнительная информация

Политика безопасности в Интернете

Используя этот сайт, вы соглашаетесь на мониторинг и аудит безопасности. В целях безопасности и обеспечения того, чтобы общедоступная служба оставалась доступной для пользователей, эта правительственная компьютерная система использует программы для мониторинга сетевого трафика для выявления несанкционированных попыток загрузки или изменения информации или иного причинения ущерба, включая попытки отказать пользователям в обслуживании.

Несанкционированные попытки загрузить информацию и / или изменить информацию в любой части этого сайта строго запрещены и подлежат судебному преследованию в соответствии с Законом о компьютерном мошенничестве и злоупотреблениях 1986 года и Законом о защите национальной информационной инфраструктуры 1996 года (см. Раздел 18 U.S.C. §§ 1001 и 1030).

Чтобы обеспечить хорошую работу нашего веб-сайта для всех пользователей, SEC отслеживает частоту запросов на контент SEC.gov, чтобы гарантировать, что автоматический поиск не влияет на возможность доступа других лиц к контенту SEC.gov. Мы оставляем за собой право блокировать IP-адреса, которые отправляют чрезмерные запросы. Текущие правила ограничивают пользователей до 10 запросов в секунду, независимо от количества машин, используемых для отправки запросов.

Если пользователь или приложение отправляет более 10 запросов в секунду, дальнейшие запросы с IP-адреса (-ов) могут быть ограничены на короткий период.Как только количество запросов упадет ниже порогового значения на 10 минут, пользователь может возобновить доступ к контенту на SEC.gov. Эта практика SEC предназначена для ограничения чрезмерного автоматического поиска на SEC.gov и не предназначена и не ожидается, чтобы повлиять на людей, просматривающих веб-сайт SEC.gov.

Обратите внимание, что эта политика может измениться, поскольку SEC управляет SEC. gov, чтобы гарантировать, что веб-сайт работает эффективно и остается доступным для всех пользователей.

Примечание: Мы не предлагаем техническую поддержку для разработки или отладки процессов загрузки по сценарию.

Вакцинная генетика наивных предшественников антител класса IGHV1-2 VRC01, наивных В-клеток человека

Идентификация наивных В-клеток класса VRC01 с использованием тетрамерных зондов и высокопроизводительного секвенирования

Несколько иммуногенов CD4bs GT были разработаны для связывания VRC01-класса предшественники BCR, некоторые из которых используют сконструированный внешний домен gp120 в качестве основной молекулы ^16,23 . Из них eOD-GT8 имеет в среднем сродство ~ 6 нМ к нескольким предполагаемым версиям зародышевой линии (iGL) bnAbs класса VRC01 ²³ .Связывая биотинилированные мономеры eOD-GT8 с флуоресцентно меченным стрептавидином (SA) для получения тетрамеров, мы ранее выделили CD4bs-специфические B-клетки из репертуара наивных B-клеток человека и идентифицировали eOD-GT8-связывающие наивные B-клетки класса VRC01 одноклеточными Секвенирование BCR, чтобы выявить, что эти клетки обнаруживаются у здоровых людей с частотой ~ 1 на 300 000 наивных B-клеток ^23,36 .

Чтобы определить, применима ли scRNA-seq на основе капель для секвенирования редких антиген-специфичных B-клеток, мы отсортировали eOD-GT8-специфические наивные B-клетки из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) трех независимых здоровых доноров и использовали 10 × Платформа Genomics Chromium для получения последовательностей BCR (рис.1 и дополнительный рис. 1). Как и в наших предыдущих экспериментах, антиген-специфические клетки были определены как те, которые связывают SA: eOD-GT8 с двумя разными флуоресцентными цветами (eOD-GT8 ⁺⁺ ), не связывая при этом нокаут-II eOD-GT8 (eOD-GT8 ^{). KO} ) (рис. 1a – c), который идентичен eOD-GT8, за исключением мутаций в CD4bs, которые предотвращают связывание клеток VRC01-класса B и их соответствующих iGL BCRs ^32,36 .

, обогащенные из PBMC здоровых доноров, окрашивали тетрамерами SA: eOD-GT8 и сортировали на IgG ^neg / eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^{В-клетки KOneg} с последующим секвенированием BCR. a — c Проточная цитометрия отсортированных клеток у донора 1 ( a ), донора 2 ( b ) и донора 3 ( c ). Отсортированные ячейки взяты из ворот, показанных синим цветом. d — f Распределение использования гена IGHV парных IgG ^neg / eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^KOneg B-клетки от донора 1 ( d ), донора 2 ( e ), и донор 3 ( f ).Полосы, соответствующие генам IGHV1-2, окрашены в красный цвет. г Распределение изотипов ЖК, коэкспрессированных с IGHV1-2. h длины LCDR3 ЖК IGKV, коэкспрессированных с IGHV1-2. i То же, что и h , но для LC IGLV. j LCDR3 последовательности наивных 5-AA IGKV LC. k Распределение использования IGKV и IGLV среди eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^KOneg 5-AA LCDR3 Наивные В-клетки класса VRC01 и их последовательности LCDR1, кодируемые зародышевой линией (справа).Гены IGKV и IGLV, показанные черным цветом, представляют собой гены, наблюдаемые в известных bnAb класса VRC01, тогда как гены, указанные красным, не наблюдались. мкл В-клетки IOMA-класса, идентифицированные с использованием тетрамерных зондов.

Сначала мы отфильтровали аннотированные последовательности VDJ. Клеточные штрих-коды, связанные с дублетами, идентифицировали по наличию двух контигов HC и / или двух контигов LC одного и того же изотипа (например, двух IGLV или двух IGKV-контигов). Дублеты и клетки без пары HC-LC были исключены из анализа.Поскольку праймеры в этой системе были разработаны для взаимодействия со всеми генами константной области IGH, мы смогли идентифицировать любые BCR IgA ⁺ или IgG подкласса ⁺ и также удалили их из анализа. Наконец, клетки, отсортированные от доноров 2 и 3, были мультиплексированы с другими отсортированными образцами по штрих-кодированию хэштега ⁴⁵ , а штрих-коды ячеек, связанные с большим количеством двойных хэштегов, были удалены. Окончательное количество восстановленных парных последовательностей BCR составило 163, 81 и 114 у доноров 1-3, соответственно (Таблица 2). Ген IGHV1-2 был высоко обогащен парными последовательностями BCR. У трех доноров от 32 до 60% HCs были IGHV1-2 (Fig. 1d-f). В целом, 71–86% LC, спаренных с IGHV1-2, были IGKV (рис. 1g). Кроме того, 37–43% LCs, спаренных с IGHV1-2 HC, имели короткий 5-AA LCDR3 (42–50% IGKV и 0–21% IGLV, Fig. 1h, i). Частоты идентифицированных тетрамерами eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^KOneg IGHV1-2 HC и доля ЖК 5-AA LCDR3 среди IGHV1-2 HC были сопоставимы с тем, что наблюдалось в исследовании на основе секвенирования по Сэнгеру. (67 и 33% соответственно) ³⁶ .Многие предшественники IGKV класса VRC01 имели последовательность LCDR3 сигнатуры bnAb класса VRC01 QQYXX и E / N / Q в позиции 4 (рис. 1j). Парные последовательности наивных В-клеток класса VRC01, выделенных от доноров 1-3, представлены в дополнительной таблице 1. Частота предшественников наивных В-клеток класса VRC01, определяемая как доля IGHV1-2 HC, спаренных с LC с 5 -AA LCDR3 среди всех наивных B-клеток колеблется от 1 на 0,14 миллиона до 0,28 миллиона B-клеток (Таблица 2), что аналогично ранее сообщенной частоте 1 из 0. 3 миллиона В-клеток ³⁶ .

Использование вариабельного гена LC среди известных антител класса VRC01 оставляет место для разнообразия, но желательно, чтобы LCDR1, кодируемый зародышевой линией, был коротким по длине или богат гибкими остатками глицина или серина, поскольку эта область антитела имеет решающее значение для размещение консервативного N-связанного гликана N276 рядом с CD4bs ³⁹ .Большинство bnAb класса VRC01 используют IGK, возможно потому, что средняя длина CDRL1 среди генов вариабельной IGK (IGKV) (6-AA) циркулирующих наивных B-клеток в репертуаре человека короче, чем у генов вариабельной IGL (IGLV) (9- AA) ³⁶ . В последовательностях от 3 доноров 70–95% BCR класса VRC01 обладали генами IGKV, экспрессируемыми известными подтипами bnAb класса VRC01 (подкласс VRC01: IGKV3-20 ³⁹ ; подкласс PCIN64: IGKV1-5 ⁶ ; N6 -подкласс: IGKV1-33 ⁴⁶ ; VRC23-подкласс: IGKV3-15 ⁴⁷ ). BCR, экспрессирующие IGKV1-12 и IGKV1-39, не присутствовали в наших предыдущих исследованиях ^23,36 . Почти все последовательности IGKV, не наблюдаемые среди известных bnAb класса VRC01, имели глицин и серин, содержащие 6 или 7-AA LCDR1 (рис. 1k).

Из нескольких наивных последовательностей В-клеток класса IGLV VRC01 средняя длина LCDR1 составляла 9-AA, в соответствии со средней длиной LCDR1 генов IGLV человека (рис. 1k). Примечательно, что мы идентифицировали два клона IGLV2-14 от двух независимых доноров, представляющих наивные В-клетки-предшественники класса VRC01, принадлежащие подклассу VRC-PG19 bnAb ^9,36 .

Ранее было показано, что B-клетки IOMA-класса могут быть выделены с использованием тетрамерных зондов eOD-GT8 ³⁶ . IOMA — это bnAb CD4bs, который имеет IGHV1-2 HC, но использует IGLV2-23 LC с 8-AA LCDR3 и немного другой способ связывания по сравнению с классическим bnAbs класса VRC01 ⁴⁸ . В нашем текущем исследовании 5 В-клеток IOMA-класса были получены от двух доноров с использованием тетрамерных зондов (рис. 1,1). В целом, эти объединенные результаты демонстрируют, что капельная scRNA-seq может быть продуктивным подходом для идентификации BCR вакцин-специфичных наивных B-клеток.

Антигенные зонды с высокой авидностью увеличивают захват В-клеток, не являющихся мишенями

Связывание В-клеток низкой аффинности с антигенами можно значительно усилить, используя мультимерные белки для повышения авидности ^{16,29,49,50,51} . Однако эффективность выделения антиген-специфичных наивных В-клеток с помощью зондов с высокой авидностью наночастиц неизвестна. Чтобы исследовать репертуар наивных B-клеток eOD-GT8-60mer ⁺⁺ eOD-GT8 ^KO -60mer ^neg , мы выполнили секвенирование BCR клеток от четырех дополнительных здоровых доноров, отсортированных с использованием eOD-GT8-60mer и eOD-GT8. ^КО -60мерные зонды (рис.2). Клетки окрашивали двумя разными способами. PBMC от доноров 4 и 7 сначала были обогащены B-клетками, затем окрашены флуоресцентными зондами и антителами, как это было сделано для всех предыдущих экспериментов с тетрамерными зондами (рис. 2a, d). Для доноров 5 и 6 все PBMC вместо этого сначала инкубировали с AlexaFluor647-конъюгированным eOD-GT8-60mer, затем обогащали клетками AlexaFluor647 ⁺ с последующим окрашиванием AlexaFluor488: eOD-GT8-60mer, Pacific-Blue: eOD-GT8 ^КО -60мер и антитела (рис.2б, в). Таким образом, процентное содержание eOD-GT8-60mer ⁺⁺ B-клеток IgG ^neg было обогащено в ~ 45 раз (рис. 2a – d, рис. 3b и дополнительный рис. 2a). Независимо от используемого метода подготовки образца, значительно большая фракция В-клеток IgG ^neg окрашивала eOD-GT8-60mer ⁺⁺ eOD-GT8 ^KO -60mer ^neg , чем при использовании тетрамеров. В результате на одного донора было отсортировано гораздо большее общее количество наивных В-клеток (таблица 3). От каждого донора было получено более 1000 парных последовательностей BCR.

Рис. 2: Наивные В-клетки класса VRC01, отсортированные по eOD-GT8-60mer.

B-клетки из PBMC здоровых доноров были окрашены зондами eOD-GT8-60mer, непосредственно конъюгированными с флуорофорами, и отсортированы на IgG ^neg / eOD-GT8-60mer ⁺⁺ eOD-GT8 ^KO -60mer ^neg B клеток с последующим секвенированием BCR. a — d Проточная цитометрия отсортированных клеток у донора 4 ( a ), донора 5 ( b ), донора 6 ( c ) и донора 7 ( d ). e — h Распределение использования гена IGHV парных IgG ^neg / eOD-GT8-60mer ⁺⁺ eOD-GT8 ^KO -60mer ^neg B-клеток от донора 4 ( e ), донор 5 ( f ), донор 6 ( г ) и донор 7 ( h ). Полосы, соответствующие генам IGHV1-2, окрашены в красный цвет. i Распределение изотипов ЖК, коэкспрессированных с IGHV1-2. j LCDR3 длины ЖК IGKV, коэкспрессированных с IGHV1-2. k То же, что и h , но для LC IGLV. l LCDR3 последовательности наивных 5-AA IGKV LC. m Распределение использования IGKV и IGLV среди eOD-GT8-60mer ⁺⁺ eOD-GT8 ^KO -60mer ^neg и 5-AA LCDR3 VRC01-наивных B-клеток. Цветовая кодировка текста такая же, как на рис. 1к. IGKV3-11, обозначенный звездочкой, не наблюдался напрямую в bnAbs класса VRC01, хотя LC VRC01 первоначально был аннотирован как IGKV3-11 ³⁷ из-за его большого сходства с IGKV3-20. n В-клетки класса IOMA, отсортированные с помощью зондов eOD-GT8-60mer.

были обогащены из донорских 9 РВМС, окрашены тетрамером eOD-GT8 или набором 60-мерных зондов eOD-GT8 и отсортированы на IgG ^neg / eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^{В-клетки KOneg} . a — b Проточная цитометрия IgG ^neg / eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^{Клетки KOneg} с использованием тетрамерных зондов ( a ) или ( b) 60mer зондов. Ячейки в синих воротах были отсортированы. c Использование гена IGHV среди парных последовательностей BCR, полученных из отсортированных клеток с тетрамером (верхний, n, = 91) и 60-мерный (нижний, n, = 2856). d Частота BCR IGHV1-2, наблюдаемая в наборах данных, отсортированных по eOD-GT8-60mer, в этом исследовании. e Характеристики LC, спаренных с тремя клонами IGHV1-2 * 05, обнаруженными из клеток, отсортированных по 60-мерам. f Три последовательности, содержащие 5-AA LCDR3, были обнаружены среди отсортированных по 60-мерам клеток от донора 9.Ни один из парных HCs не был IGHV1-2.

Относительное использование гена IGHV1-2 среди eOD-GT8-60mer ⁺⁺ eOD-GT8 ^KO -60mer ^neg B-клеток у каждого донора составляло от 9 до 22% по сравнению с 32–60% при использовании тетрамера зонды (рис. 1d – f и 2e – h). Последовательности парных наивных В-клеток класса VRC01, выделенных от доноров 4-7, представлены в дополнительной таблице 2.Среди В-клеток IGHV1-2 ⁺ соотношение IGKV к IGLV было таким же, как у BCR, отсортированных по тетрамерам (рис. 2i), но только 2,4–8,6% IGKV и 0–2,9% BCR IGLV обладали 5-AA. LCDR3s независимо от изотипа LC (рис. 2j, k). Одноклеточное секвенирование по Сэнгеру eOD-GT8-60mer ⁺⁺ eOD-GT8 ^KO -60mer ^neg B-клеток у другого донора (донор 8) также обнаружило низкие частоты HCs IGHV1-2, из которых только одна была в паре с 5-AA LCDR3 LC (дополнительный рис. 2a – c). Таким образом, разница в скорости восстановления последовательности BCR класса VRC01 между клетками, отсортированными с использованием тетрамерных и 60-мерных зондов в этом исследовании, не была артефактом, связанным с методом секвенирования.Все наблюдаемые последовательности наивных В-клеток класса VRC01 среди связанных с eOD-GT8-60mer B-клеток имели особенности, напоминающие bnAbs класса VRC01 (рис. 2l, m). Интересно, что остатки гистидина часто наблюдались в LCDR3 нескольких последовательностей, выделенных от доноров 5 и 6. В предыдущих исследованиях мономерное связывание eOD-GT8 с наивными антителами класса VRC01 определялось для отсортированных по eOD-GT8 наивных B-клеток человека ^{23 , 36} . В этом наборе данных, экспрессированные антитела с гистидином, содержащим LCDR3, имели константы диссоциации ( K _D ) в пределах диапазона антител без остатков гистидина LCDR3 (дополнительный рис.2г). Три B-клетки IOMA-класса также были обнаружены среди B-клеток, отобранных от доноров 4, 6 и 7 (рис. 2n). Эти данные предполагают, что eOD-GT8-60mer связывает редкие наивные В-клетки класса VRC01, как и было задумано, но высокая авидность антигена захватывает более разнообразную популяцию В-клеток в гораздо большей степени, чем тетрамеры. В соответствии с этим наблюдением, окончательные рассчитанные частоты предшественников B-клеток класса VRC01, идентифицированные зондами eOD-GT8-60mer, находились в диапазоне от 1 на 0,08 до 0,38 миллиона наивных B-клеток, что соответствует диапазону, аналогичному частоте предшественников, определенной с использованием тетрамерных зондов eOD-GT8 ( Таблица 3) ^23,36 .

IGHV1-2 * 05 не может связывать CD4b ВИЧ VRC01-подобным образом

В ходе нашего исследования мы идентифицировали одного донора (донор 9), у которого было примерно в десять раз меньше eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^{Наивные В-клетки KOneg} , идентифицированные с использованием тетрамеров, по сравнению с предыдущими донорами (рис. 1a – c и 3a). Мы секвенировали отсортированные по тетрамерам eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^{В-клетки KOneg} с помощью капельной scRNA-seq и обнаружили, что, к удивлению, ни один из BCR не экспрессировал ген IGHV1-2 (рис.3в). Когда наночастицы eOD-GT8-60mer использовались в качестве зондов для окрашивания клеток донора 9, частота наивных B-клеток eOD-GT8-60mer ⁺⁺ eOD-GT8-60mer ^KOneg была аналогична той, что наблюдалась у других доноров. от которых мы смогли выделить наивные В клетки VRC01-класса (Fig. 2a-d, Fig. 3b, and Supplementary Fig. 2a, ref. ³⁶ ). Около 3000 парных последовательностей BCR были получены из отсортированных по 60-мерам В-клеток от донора 9, но только три клетки экспрессировали ген IGHV1-2 (рис. 3c, d), и ни одна из трех В-клеток IGHV1-2 ⁺ не экспрессировала LC совместно с 5-AA LCDR3 (рис. 3e). Сходным образом HCs в паре с несколькими LC 5-AA LCDR3, наблюдаемыми в наборе данных, не экспрессировали IGHV1-2 (Fig. 3f). Три последовательности IGHV1-2 были аннотированы как аллель * 05, который, как предполагается, не подходит в качестве предшественника класса VRC01 из-за отсутствия остатка W50, кодируемого зародышевой линией, который формирует консервативное взаимодействие с N280 gp120 во всех bnAbs ^{класса VRC01. 16,38,40} . Поэтому мы предположили, что у этого донора были два аллеля IGHV1-2 с пониженным потенциалом развития bnAbs класса VRC01.Генотип IGHV1-2 донора 9 был затем определен как IGHV1-2 * 05 / * 05 с помощью целевой ПЦР, клонирования и секвенирования по Сэнгеру (дополнительный рис. 3а). Таким образом, как сортировка отдельных клеток, так и групповое секвенирование, а также генотипирование идентифицируют этого субъекта как человека с репертуаром В-клеток, несовместимым со связыванием eOD-GT8 из-за отсутствия IGHV1-2 W50 ^16,38,40 .

На частоты предшественников eOD-GT8-связывающих наивных В-клеток IGHV1-2 влияет аллельная вариация

Помимо эффектов аллеля * 05, мы также наблюдали различия в частотах В-клеток IGHV1-2 ⁺ , связанные с другими Аллельные варианты IGHV1-2.Примечательно, что среди наших доноров тетрамеров донор 1 с самой низкой частотой В-клеток IGHV1-2 ⁺ (32%) был гомозиготным по аллелю IGHV1-2 * 04 (рис. 1d и дополнительный рис. 3b). Частота наивных предшественников В-клеток класса VRC01 у этого донора была ниже примерно в 2 раза, 1 на 0,25 миллиона по сравнению со средним значением 1 на 0,15 миллиона наивных В-клеток у доноров 2 и 3 (Таблица 2), которые оба были * 02 / * 04 гетерозиготы. Интересно, что у доноров 2 и 3 мы также наблюдали, что большинство идентифицированных BCR IGHV1-2 используют аллель * 02 (рис.1д, е). Сходные паттерны использования аллелей наблюдались среди отсортированных по 60-мерам В-клеток от доноров 4-7 (рис. 2e-h). Считается, что из 7 курируемых аллелей IGHV1-2 в IMGT все известные в настоящее время bnAb класса VRC01 происходят от аллеля IGHV1-2 * 02 ^6,39,40 . Аллели * 02, * 03, * 04 и * 07 имеют кодированные зародышевой линией остатки W50, N58 и R71 (нумерация по Кабату), необходимые для VRC01-подобного распознавания CD4bs ^16,40 (рис. 4a). Вероятно, что аллели * 01 и * 03 являются старыми артефактами секвенирования ⁵² , что объясняет, почему аллель * 03 еще не наблюдается среди В-клеток VRC01-класса.Аллель * 07 до сих пор не наблюдался у доноров, вероятно, из-за редкости, поскольку аллель * 07 был аннотирован только недавно (GenBank: MN337615) ⁵³ . Аллель * 04 отличается тем, что он кодирует W66 в каркасной области (FWR) 3 вместо аргинина, обнаруженного в других аллелях IGHV1-2. Аргинин является предпочтительным остатком в положении 66 среди всех аннотированных функциональных генов IGHV человека (фиг. 4b). Следующими наиболее распространенными вариантами в этой позиции являются Q66 и H66, оба из которых сохраняют полярные боковые цепи.Мы предполагаем, что гидрофобный остаток триптофана, экспонированный на поверхности антитела, кодируемого IGHV1-2 * 04, может влиять на растворимость BCR, тем самым влияя на развитие B-клеток IGHV1-2 * 04. Аллель * 06 представлен аргинином в позиции 50 AA, аналогично аллелю * 05, который может препятствовать способности кодируемых IGHV1-2 * 06 BCR превращаться в bnAbs класса VRC01. В свете вышеизложенных результатов в отношении IGHV1-2 * 04, * 05 и * 06, мы стремились изучить сигнатуры аллелей IGHV1-2 на уровне популяции.

a Выравнивание аминокислотной последовательности семи аннотированных аллелей IGHV1-2. Аллель IGHV1-2 * 02 показан в качестве эталона. Показана схема нумерации остатков по Кабату. Остатки, выделенные синим цветом, указывают положение ключевых остатков в IGHV1-2, необходимых для связывания с CD4bs. Позиция 66 для остатков показана зеленым. b Из всех курируемых IMGT функциональных генов IGHV ( n = 296) большинство генов используют остаток аргинина в положении 66.

Вариация частоты аллеля IGHV1-2 среди этнических групп человека

Для изучения предполагаемых частот аллелей и генотипов при однонуклеотидных полиморфизмах (SNP) внутри IGHV1-2 среди различных подгрупп населения мы сначала использовали транскриптомные данные, полученные наивных В-клетках, из Когорта DICE (база данных экспрессии иммунных клеток, локусов количественных признаков экспрессии и эпигеномики) ⁵⁴ , представляющая этнически разнообразную коллекцию доноров ( n = 75; афроамериканец, n = 5; азиат, n = 17; европеоид, n, = 34; гавайец / житель островов Тихого океана, n, = 3; смешанная этническая принадлежность, n, = 15; неизвестно, n, = 1). Мы сосредоточили наш анализ на трех основных SNP (rs1065059, rs112806369 и rs12588974) в этом наборе данных, которые дифференцируют аллели IGHV1-2 * 02, * 04, * 05 и * 06 (рис. 5a; дополнительный рис. 4). Используя всех лиц в этой когорте с достаточным картированием считываний РНК-seq в этих положениях, мы вывели генотипы SNP (дополнительный рисунок 4) и генотипы на основе аллелей IGHV1-2 (рисунок 5a и дополнительная таблица 3). Основываясь на заключении об аллелях, аллели * 02, * 04 и * 06 наблюдались с частотами 42, 43 и 13% (дополнительная таблица 3).Наиболее распространены генотипы * 02 / * 02 (18,6%), * 02 / * 04 (34,6%) и * 04 / * 04 (18,6%), за ними следуют * 02 / * 06 (12%) и * 04. / * 06 (14,6%) гетерозигот (рис. 5а). Доказательства аллеля * 05 были ограничены (1/75 человек), и гомозигот * 05 / * 05 в этой когорте не наблюдалось (рис. 5a). Точно так же мы не наблюдали аллели SNP, представляющие * 01, * 03 или * 07 (дополнительный рис. 4). Примечательно, что, в отличие от * 05, в популяции относительно преобладали как аллели * 06, так и * 04 (рис. 5a).В частности, люди с отсутствием аллеля * 02, представленные генотипами * 04 / * 04 и * 04 / * 06, наблюдались с коллективной частотой ~ 33% в общей когорте. Частота этих генотипов была умеренно выше как в кавказской (41%), так и в смешанной (40%) подгруппах (рис. 5а). В данных секвенирования BCR eOD-GT8 ⁺⁺ eOD-GT8 ^KOneg мы наблюдали, что аллель * 04 был связан с пониженной частотой предшественников В-клеток класса VRC01 по сравнению с * 02 среди предполагаемых гетерозигот * 02 / * 04 ( Рис.1 и 2 и таблицы 2 и 3). Следовательно, эффективность прайминга В-клеток класса VRC01 у людей * 04 может быть снижена по сравнению с индивидами, несущими аллель * 02.

a Число особей каждого предполагаемого генотипа IGHV1-2 в коллективной когорте (слева) и в каждой подгруппе населения (справа) на основе выводов аллелей, сделанных с использованием данных RNA-seq ( n = 75 доноров). b Число индивидуумов каждого генотипа IGHV1-2 на основе выводов, сделанных на основе данных RepSeq экспрессированных IgM / IgD антител ( n = 84 донора). c Использование гена IGHV1-2 в репертуаре IgM / IgD, разделенном генотипом IGHV1-2 ( n = 83 донора). d Использование гена IGHV1-2 в репертуаре IgM / IgD, разделенном по генотипам в SNPs rs112806369 и rs1065059 ( n = 83 донора). e Аллель-специфическое использование IGHV1-2 в репертуаре IgM / IgD у гетерозигот IGHV1-2 (* 02 / * 04, n = 28 доноров; * 02 / * 06, n = 6; * 04 / * 06, n = 14).Все диаграммы построены следующим образом: центральная линия, медиана; границы бокса, верхний и нижний квартили; усы, 1,5-кратный межквартильный размах; точки за пределами усов, выбросы. Односторонний дисперсионный анализ: *** P <0,0001; **** P <0,00001; нс не имеет значения.

Частоты аллелей в SNP внутри IGHV1-2 варьируются в разных группах населения 55

Использование вариабельного IGHV1-2 в репертуаре наивных IgM / IgD связано с отдельными аллелями

Предыдущие отчеты выявили различия в использовании аллель-ассоциированного гена IGHV в репертуарах наивных и антиген-стимулированных В-клеток ^{57,58,59,60, 61} . Учитывая это, а также очевидный предпочтительный отбор аллеля IGHV1-2 * 02, наблюдаемый в наших данных секвенирования V (D) J, мы затем исследовали, наблюдались ли модели использования искаженного аллеля IGHV1-2 в наивном репертуаре на уровне популяции.Для этого мы использовали отдельный общедоступный набор данных секвенирования экспрессируемого репертуара IgM / IgD (RepSeq) из когорты здоровых доноров ( n = 84) ^62,63 . В соответствии с данными генотипа, приведенными выше, среди лиц, включенных в набор данных RepSeq, мы наблюдали присутствие аллелей IGHV1-2 * 02, * 04 и * 06 с самыми высокими частотами (дополнительная таблица 3), представленных * 02 / * 02 (20,2%), * 04 / * 04 (21,4%), * 02 / * 04 (33,3%), * 02 / * 06 (7,1%) и * 04 / * 06 (16,6%) (рис.5б). Только один гетерозиготный субъект нес аллель * 05 (* 04 / * 05). Опять же, очевидная низкая распространенность * 05 может быть связана с низким использованием этого аллеля ⁵⁷ ; частота использования, наблюдаемая у человека * 04 / * 05, составляла 1,3%. Мы наблюдали диапазон частот использования IGHV1-2 у остальных субъектов (0,06–14%), который, как мы обнаружили, связан с аллельной изменчивостью (односторонний дисперсионный анализ (ANOVA), влияние генотипа, P = 3,76e). −10; рис. 5в). В соответствии с наблюдениями, обсужденными в предыдущих разделах, гомозиготы * 04 / * 04 имели наименьшее использование IGHV1-2 по сравнению со всеми другими генотипами (односторонний ANOVA, P = 2. 14e-10 по сравнению с * 02 / * 02; P = 2,82e-09 по сравнению с * 02 / * 04; P = 1,86e-07 по сравнению с * 02 / * 06; Рис. 5в). Однако использование в гетерозиготах * 04 / * 06 существенно не отличалось от * 02 / * 02 (односторонний дисперсионный анализ, P = 0,12). Этот эффект * 04 на использование IGHV1-2 был четко заметен, когда мы сгруппировали субъектов по генотипам по SNP rs112806369 (рис. 5d), который отличает * 04 (T) от аллелей * 06 и * 02 (A). Лица с генотипами A / A и A / T имели более высокое использование IGHV1-2, чем у людей с генотипом T / T (односторонний ANOVA, P = 1.46e − 11; Рис. 5г). Напротив, разделение субъектов по генотипам по SNP rs1065059, который отличает * 06 (C) от * 04 и * 02 (T), не выявило значимых различий (односторонний ANOVA, P = 0,21; рис. 5d). В соответствии с более ранними наблюдениями ^60,61 , мы также наблюдали систематические ошибки использования аллеля * 04 в гетерозиготах IGHV1-2 (рис. 5e). У индивидуумов генотипов * 02 / * 04 и * 04 / * 06 использование * 04 было значительно ниже, чем у * 02 (односторонний ANOVA, P = 6. 65e-12) и * 06 аллели (односторонний ANOVA, P = 0,0003). Это контрастировало с аллель-специфическими паттернами в гетерозиготах * 02 / * 06, в которых оба аллеля использовались с сопоставимой частотой (односторонний ANOVA; P = 0,47). Эти результаты предполагают, что смещение использования * 02 относительно других аллелей IGHV1-2 среди bnAbs класса VRC01 и наивных В-клеток, вероятно, происходит из-за генетического воздействия на частоты рекомбинации V (D) J и / или экспрессию BCR.

.האוואנער לעבן

Полный текст H.

Полный текст на этой странице автоматически извлекается из файла, указанного выше, и может содержать ошибки и несоответствия.

 Форма F * R 28j
*
ПЕРЕДАЧА ПРЕССЫ
10
ЧАС
Освобожден от пуб ликации
Пятое утро, 23 июля;
Не ранее .

Совет управляющих

Федеральной резервной системы
27 июля 19 г.

СОСТОЯНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОГО РЕЗЕРВА БАТИКС

-В течение недели, закончившейся 26 июля, банк-участник
39 000 000 долларов.5 3 000 000 денежных средств в денежном выражении и 5 I 43 000 000 денежных средств в денежном выражении.
.
Казначейство размещает это в федеральных резервных банках
26 июля должны были составить около 1 300 000 000 долларов.
Был получен доход в размере 22 * ​​6 000 000 долларов США за единый счет.
Государственные ценные бумаги :
b i l l s i n c r e a s e d - 272 000 000 фунтов стерлингов; Примечания о создании
5 000 000 долларов США и облигации 2 2 1 000 000. 
Изменения в банке-члене, внесение изменений в список и внесение изменений в
в / -..; ek и год, закончившийся 26 июля I 9W, были такими же:
4

Предусмотрена или объявлена
■ поскольку

26 июля ‘
I9W
4

28 июля,
191 + 3

19 июля,
19I4
Я +

(В миллионах долларов)
Правительство США, секция (i n c l. ¿U a r. S e c.)
L oans, d is c o u n ts и авансы
Резервный банк Jther c r e d i t

горит, 30 2
1+
8
27li

Итого резервный банк c r e d i t
Золото с т о к к
Валюта казначейства

15 121+
20 996
это, 111

+ 12Ç ■
- 51.
+ 2

Банк-член r e s e r v e b a la n c e s
l.ioney in c i r c u l a t i o n
Наличные деньги казначейства
Казначейство подчиняется Ф.Р. Бэнкс
Членство в сети
учетные записи

12 793
22, 581 +
2313
1 + 03
2, 136

+ 39

+6 851
+
23
- 167

+ 2J.6
4
- 2
-II8




+

53

- 35
+ ¿-3
4
- 2 тыс.

;

+6 706
-1,338
21 год
+ 1 8+
+1
+ я +, 7S'5
+ 1+
1
- 156
+ 236

Форма 283c
ЗАЯВЛЕНИЕ ПО УСЛОВИЯМ ФЕДЕРАЛЬНОГО РЕЗЕРВА НА 26 ИЮЛЯ, 1 ИЮЛЯ
EN
F
F H
АК Н
(В тысячах долларов США)
Итого- Бостон
Л И А Б И Л И Т И Е С
Примечания Feaeral Reserve
18 995 287 j 21+
0,631
Депозиты:
Резервный банк-участник. 12 792 593 610 579
Генеральный казначей США a c c t.79675 100, 781+
Прочие льготы, включая начисленные дивиденды
7,5¿ + 6
780
ВСЕГО ОБЯЗАТЕЛЬСТВА
35 313 ​​871+ 20 7 7 071
Оплаченный капитал
Излишек (Раздел 7)
Излишек (Раздел 13b)
Прочие счета капитала
ИТОГО ОБЯЗАТЕЛЬСТВА AED
капитал '; .cc w t s
Обязательства принять
промышленные ссуды

Hew York

1 2 +, 707
+1 7
1 + 197, 007
106 982
1/538 922
255 780
5098 691
2o2, 057

3,61 + 8

Общий




Клив.

Богатый*

A tla n ta

1266,328 1685,713 1230,277 1088,956 3521 +, 019
635,1476 1015,086
25 700
1 1, 1 + 81
+
126, U86 122,362
9,122
8,1 + 23
796,781+ 1187,352
79,563 13л +, 607

Минн.Чикаго Сент-Луис

800 011+ 1 20 592
+

Канс. Сай.

Даллас СанФран.

697 703

л +
61 +, 802 2328,51 + 5

2
518, 821+ 526,1 + 71 + 196! +, 959 U + 5,506 231,301 601,1 51+ 526,385 li + 69,0l +
+
13 988
23 606
13 576
8 965
10 969
23 765
35 711
75 383
1 2 620 30, 21+
+
39 371 107 303
7
39 871
5л, 99ч
1 + 3,995 170,1 + 31
l +, 226
10,81 + 0
3 001
1, 20i + 36,1 + 1 + 3
+
■ 1, 91+?
7 217
12 993
601,650 601J451 2131+, lld + 509,935 323,511+ 657, 262. 5314,536 1633,171
58,976 17л | -, 007
57i76l + 27, 1 + '7l +, 085
102 513
73 130 20 27 50
31+

526
5OI
231+
616
1,022
231
219
29b
1 959
791
273
191, 221+
96io, iai + t 21Ì43,206 3008,1 * 63 1931,721+ 1761 +, 153 5911935 -1367,991+ 771,759 1I +
29 323 1108 608 I +
159 182
5 012
12 106
6 376
18 830
13 370
16, 221+
1, 868
+
3,1 + 58
9,91 * 7
58, 123 ’
5,155
5713
13 206
70 012.16 026
5 236
26,1 * 90 • 6,330
б, 331
li +, 159
183 097
3669 • l +, 55l +
17 859
5725
• 1, 1 + 21
+
26 965
1,000
7 092
2,871+.
3 290
2,129
1 007
530
1,307
1,137
7I +
9
1,1 + 29
3,662
1 + 0,580
9820
я + .iSo *
5770
я +, 979
12 037
82,21 + 5
18 987
5,1 + 65
1 +, 155
5 055
3 505
*
*
+
35,775,363,2107,678 9761.Ù623 2183,057 3051,51: 0 1955,396 1781,395 5970,771 1383,227 781 +, 066 л л M, 32 л + 1123,1 + 20 1 225,861
8

275

Ф. Р. отмечает выдающиеся
19 703 192 1283 675 • ■
- 1 + 1 + 23,399
Дополнительная информация для заметок F.R.
принадлежит 1. Р. /.мужские:
Золотые цертификаты
12, 155 000 * 7 + »000 '2770 000
11
Электронная бумага для печати
32,96o
19 615
2,275
Правительство США se cu ritie s
7 950 761 600 000 1700 000

Скидки и авансы
Промышленные кредиты
U. S „Govt * s ecu r itie s
(i n c l. guar, s e c.)

P hila.

37-, 185
10,71 + 9
л л; f 802, 2lli.

-
-
50
2 005
959
1300 912 1727 117 1271 321+ 1152 671+ 3598 716
610 000 1028 000
-
ли., 200
700 000 700 000

775 000
1,720
525 000

660 000 2520 000
-
-
500 000 1100 000

1+
8

1,175
18

2, lji + 0

1; .6U

8, 195 •
196

725 126

1 99,611 2l4l + 9,3l + 3
+

375 000–216 000
----:
л +, 320
550 761 225 000

2 + 30 ¿ооо
330
300 000

256 000 1771+., 371
17 800
1 / После вычета 87 U, 03 000 U03 000 акций других Федеральных резервных банков,

957 302

1, 031, 23U

из F.

Р. 23? а

Выпущено для пуб ликации в пятницу r.orfcing; .28 июля 19UU; Не ранее
statei:?; nt of. состояние
c
O TK TW LV ФЕДЕРАЛЬНЫЙ / РЕЗЕРВНЫЙ B N S C'M
F i!
E E
АК
BIIJED
(В тысячах -> f долларов)

Увеличить или уменьшить
поскольку
26 июля,
19 * i4

28 июля,
1945 г.

19 июля,
1944 г.

РЕСУРСЫ
Золотые ценные бумаги под рукой и
причитается из Казначейства США
Выкупной фонд - Ф. Р.п:.) тес
Прочие наличные
Итого. Резервы
Скидки и авансы
Промышленные кредиты
Правительство США, ценные бумаги:
Болезни
Сертификаты
Пылинки
Облигации
Всего Правительство США. ■ ценные бумаги
(в c l. ¿: uar. se c,)
Всего кредитов и ценных бумаг ■
Средства в иностранных банках
F \ R. банкноты других банков
Несобранные предметы
Помещение банка
Прочие активы
ИТОГО АКТИВЫ

18 399 125
¿+25 735
. 290,30 тыс.

- 54 000
. •. 1820
+
+. 3648

Т1, 712.090
+ 572,225
6k, 446

19-, 115,16к
37 185
10,7к9

48 532
1, 7к5
196

-l, 4 o 4, 3 H
+
24 180
-
1,377

+ 272 102
'4, 8oo
21 460

+4 266 657
+2 290 290
1 409 671
- 115 412

♦ 245 342

+6, 851 206

., 602 211 •

-

-

Л И А Б И Л И Т И Е С
Банкноты Федерального Резерва!
Депозиты:
Банк-участник - резервный счет
Казначей США i- общий счет
Иностранный
Другой
Всего депозитов
-Отложено несколько предметов
Прочие лиги, включая
начисленные дивиденды
ВСЕГО ОБЯЗАТЕЛЬСТВА
К А П И Т А Л ОТЧЕТЫ
Капитал оплачен irjt.
Излишек (Раздел 7)
Излишек (Раздел 13b)
Прочие счета капитала
ИТОГО ОБЯЗАТЕЛЬСТВА И КАПИТАЛЬНЫЕ ОТЧЕТЫ
M
1

:

Отношение к l1 resprfes
ИЭП Осит
и F. R. note l i a b i l i t i e s c 'r.4+
+ 42,958
- к 7, 137
+ 22, 593

1,3147,675

- 124 915

+ 435 418
- 156 497
214 479
12 537
+ 528 815
f 225 788

• 0,7 546

+

76c

+

-35 »318» 374

-

52; 857

159 182
■ 1-8, 097 •
626,96 5 '
82,2к5
35 775 363: '
j
.56: 3-1;
3,648 '

+

56 915

72
-------

+
-

1,091
51 674
п рф

¿I55

1 965
+5 525 620

+
+
+
-

10 271
27 686
156
6,122

+5 555 591
-

15,3 фунта стерлингов
8 227

Форма F. R.

283b
СТАТЕМ
ПРИНЯТИЕ УСЛОВИЯ ЗАПРЕТА ФЕДЕРАЛЬНОГО РЕЗЕРВА
F
F
E
KS O 26 ИЮЛЯ 1944 ГОДА.
N
. (В тысячах долларов)

РЕСУРСЫ
Общий
Золотые ценные бумаги под рукой и
причитается от У.5 # 735
Прочие наличные
290 304
Общие резервы
Скидки и авансы
Промышленные кредиты
Правительство США:
Б илс
Сертификаты
Примечания
Облигации

Бостон

Нью-Йорк

985 617 1 + 830 996
27 796
99 764
73 254
19 'нЮ

19,115,164 1033,127 5004,014
37 185
10 749

2,275
1,533

19 615
89

Фила.

Клев,

91 + 0,370 1490,601
35 420
35 291
21 995
23 414

Богатый.

Атланта

"Chicapro" S t .L o u - это

614 162 359 790
28 612 11 495
6 467
13 367

687 581
li *, 1i4-2
13 272

494 811 2517 143
12.9U1
50 342
9 182
28 339

997,656 1549,443 IO37,490
.4200
1,720
187
4 359
355

956 831 3674 657

715 295

3 300

656 141 377 752
-
4820
--- 198

21+
.5i6 * 93l + 2595, Ö
-
--- 3,970

585 468
278 095
93 171
111 826

364 155 1346 282
207,1 + 89 376 518
69 516 126 145
83 435 151 402

361, 71 + 2 187,1 + 97
163 315 100,1 * 15
54 715 33 643
65 670 1 + 0,379

329 331
176 522
59 139
70 980

262 753
152 635
51 138
61 377

645,1 + 42 361 934

635, 972

527 903 1405 697

650 262 362 132
4
'3
5 625
4 773
65 915 36 248
1,266
2,041
1892
‘3, 239

636 327
4
7 149
79 602
2 700
3 247

09 667
527 903 11+
11
4
16, 821 *
3,550
71 110 194 462
1 979
■
9I + 7
2 972
7 094

925
33

1077 119 1327 131
12
12
3, i4 o
3,54?
96,849 159,75?
4, l4 6
3,516
7 500
4 765

783 892
6
10 957
115 594
2 887
4,570

725 553
4
1,197
86 365
1,629
3 816




0
0

£
-0

Всего кредитов и
безопасность
14 850, 11 + 8
Средства в иностранных банках
136
Ф.0,634
28 413
18,41 + 3

8, 927 217 504 292 3139 460
3 381 990 256, 11 * 2 710 536
1, 133 071
85 813 238 051
1 359 936 102 995 285 714
Всего Правительство США, ценные бумаги
(i n c l. guar, s e c.)
14 802, 214 949,21 + 2 4373 761

953 050 1 + 393 465
10
1/49
1850
15 385
113 421 329 626
1,638
9 002
4,582
13 087

Минн.

17
9,399
272 302
2 912
7 837

2183,057 3051,5140 1955 * 396. 1781 395 5970 771

330
25

1383 227 784 066 liii +, 324.

l / После вычета отчислений в размере 87 * 000 долларов в пользу другого Федерального резерва; Банки"

781,84i
359 126
120 320
141+, 410

1123 420 4225 861

 

% PDF-1.4 % 10 0 obj >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 15 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 5 0 obj >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 6 0 obj >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 7 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 4 0 obj >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 11 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 16 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 3 0 obj >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 12 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 14 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 1 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 8 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 13 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 9 0 объект >>> / BBox [0 0 593.97 756] / Длина 118 >> поток x% ̻ @ F ~ / 5ѽ @ P4ji5 / 01q__9wd ܓ áU٣lehuGuҡOt6l% G] | A ߟ wf y конечный поток эндобдж 18 0 объект > поток iText 4.2.0 от 1T3XT1.42021-11-18T00: 37: 13-08: 00Apache FOP Version 1.02021-11-18T00: 37: 13-08: 002021-11-18T00: 37: 13-08: 00 конечный поток эндобдж 19 0 объект > поток х +